1. Історія питання
2. За що ж дали Нобеля?
3. Чи не мухами єдиними ...
4. Подальший розвиток

Сьогодні вранці, 2 жовтня, в Каролінському університеті в Швеції оголосили лауреатів Нобелівської премії з фізіології і медицині за 2017 рік. Ними стали американські дослідники Джеффрі Хол, Майкл Росбаш і Майкл Янг. Премія буде вручена «за відкриття молекулярних механізмів контролю циркадних ритмів». Що ж це за ритми і які механізми ними керують? Чому це настільки важливо?

- Настає ніч. Місто засинає, прокидається мафія.

Те, що активність живих істот залежить від часу доби, було відомо з давніх-давен. Всі знають, що корови пасуться вдень, півні співають вранці, а кошенята хапають сплячих людей за п'яти о другій годині ночі. У кожного виду живих істот, від одноклітинних ціанобактерій до величезних багатотонних китів і вікових дерев, періоди активності змінюються періодами відпочинку, в певний час дня викидаються ті чи інші гормони, листя згортаються і розгортаються як по годинах. Але що це за годинник? Яка їхня природа? Чимало списів було зламано за ті 300 років, що люди намагалися відповісти на ці питання. Нобелівську премію цього року заслужено дали людям, які поставили якщо не крапку, то як мінімум жирну риску, що розділила науку про механізми, що обумовлюють циркадні ритми, на «до» і «після».

Історія питання

Найбільш логічною відповіддю на питання, звідки береться ця періодична активність, представляються сонячний годинник. Мовляв, сонце встає, активність «денних» видів підвищується, а «нічних» снижется. Основним регулятором є освітленість, а також супутні їй фактори - зростання і падіння температури, зміна напрямку вітру і все в тому ж дусі. Ця парадигма активно застосовувалася ще древніми римлянами , День яких починався в момент сходу сонця над горизонтом, а ніч - в момент заходу. Так як і день, і ніч складалися з 12 годин, довжина години у римлян залежала як від того, нічний це годину або денної, так і від пори року.

Першим перевірити, чи дійсно саме зовнішні чинники визначають активність живих істот, взявся французький астроном Жан-Жак де Меро на початку 18 століття. В як модельний організм він використовував мімозу, яка дуже явно реагує на зміну дня і ночі - в світлий час її маленькі ніжні листочки розгорнуті до сонця, а в темний складені і опущені вниз. Де Меро помістив мімозу в темний ящик і з подивом спостерігав, як ще близько тижня вона своєчасно повертала і розгортала листочки незважаючи на відсутність стимуляції світлом (рис. 1). На основі цього він зробив припущення, що ритм цього процесу задається зсередини, а не зовні.

Малюнок 1. Досвід Де Меро. Астроном зауважив, що мімоза зберігає здатність вранці розгортати листочки, а вночі згортати їх назад навіть без впливу сонячного світла.

Як найчастіше відбувається в таких випадках, нове явище до пори до часу було забуте, а на початку 20 століття перевідкрито. Протягом багатьох десятиліть велися палкі дебати між ідеологами «внутрішнього годинника» і «чинників середовища», поки в 1971 році не була опублікована проривна стаття каліфорнійських вчених, де вони показали, що циркадні ритми мають генетичну природу. Ідея нетривіальна, так як навіть прихильники «внутрішнього годинника» вважали, що якщо вони і мають генетичну природу, то число задіяних генів має бути дуже велике, і вплинути мутаціями на цю ознаку значуще не вийде.

В якості моделі використовували плодових мушок дрозофіл. Час було дике, ампліфікатори [1] і секвенатори [2] ще не винайшли, а замість піпеток в лабораторіях були кам'яні сокири. Експериментатори лили на яйця мушок мутагени, викликаючи зміни в випадкових генах. І зуміли отримати три різних за «ритміці» лінії дрозофіл. Перша лінія мала циркадний ритм тривалістю 28 годин, друга - 19 годин, а в третій зазвичай ритмічні параметри взагалі не підпорядковувалися жодному помітного циклу (рис. 2). Шляхом довгих пошуків методами класичної генетики дослідники змогли локалізувати відповідальний за зміни ділянку. Це виявився ген в статевий Х-хромосомі, який був названий period [3] . На той момент, за відсутності молекулярних методів, рухатися далі було неможливо. Що це за ген і як він працює - залишилося загадкою.

Малюнок 2. Мутантні дрозофіли з порушеними циркадних ритмів. Різні мутації в гені period можуть змінити тривалість циркадного циклу в більшу або меншу сторону або навіть повністю його знищити.

За що ж дали Нобеля?

В середині 1980-х, коли кам'яні сокири вже відійшли на другий план, а в лабораторіях біологів боязко обживали перші ампліфікатори, в США над проблемою циркадних ритмів працювали дві групи. Перша під керівництвом Джеффрі Холла і Майкла Росбаша трудилася в Брандейском університеті в Массачусетсі, друга під керівництвом Майкла Янга - в університеті Рокфеллера в Нью-Йорку. Приблизно одночасно ці групи змогли клонувати ген period, секвенувати і вивчити його послідовність. Перші дані про структуру гена і кодованого їм білка не дали чіткої відповіді про механізми його роботи, породивши безліч курйозних теорій.

Незрозуміло було, перш за все, на якому рівні діяв цей ген. Більша частина будувалися тоді припущень відносила його продукт, який отримав назву PER, до мембранних білків, які або регулюють доступ в клітку якого-небудь діючої речовини ззовні, або змінюють характер взаємодії клітин між собою. Одне було ясно - повинен існувати певний осцилятор з періодом в 24 години і його робота повинна бути безпосередньо пов'язана з білком PER.

І цей осцилятор був знайдений - ним виявився, як не дивно, сам білок PER. Хол і Росбаш показали, що в нейронах мухи концентрація цього білка має 24-годинну циклічність з піком близько опівночі. Такому ж циклу виявилася схильна до мРНК цього білка, проте пік її концентрації виявився зрушать на кілька годин раніше по відношенню до піку білка (зазвичай такі піки повинні збігатися). Дослідники отримали нонсенс-мутантів з цього білку (при цьому мРНК синтезується, а білок - немає) і побачили, що при цьому періодичні зміни концентрації мРНК пропадають. Висновок не забарився - білок PER є ядерним модулятором транскрипції і блокує власний синтез (рис. 3 а).

Малюнок 3. В організмі діє осцилятор, що складається з білків, негативно регулюють експресію власної мРНК. За рахунок розгалуженої системи позитивних і негативних регуляторів осцилятор має період приблизно о 24 годині і може підлаштовувати свою роботу під зміни світлового дня.

На основі цього висновку запропонували гіпотезу TTFL (Transcription-Translation Feedback Loop - транскрипційно-трансляційної зворотного зв'язку). Відповідно до цієї гіпотези, осцилятор, який відповідає за циркадні ритми, складається з одного або декількох білків, які контролюють власну експресію за допомогою негативної регуляції транскрипції і / або трансляції. Було зрозуміло, що один ген period не здатний повністю побудувати циркадний ритм, йому потрібні партнери.

Цих партнерів виявив Майкл Янг. Він виявив ген, названий їм timeless, мРНК і продукт якого (білок TIM) також піддавалися 24-годинним осциляціям. Виявилося, що білки PER і TIM можуть потрапити в ядро ​​тільки провзаємодіяти один з одним. Один без іншого працювати не здатний і навіть більш того - без зв'язку вони моментально руйнуються в Протеасома. Разом же вони потрапляють в ядро і блокують власну експресію (рис. 3 а).

Надалі виявили також і позитивні регулятори експресії цих генів, що ще сильніше ускладнило картину. Виявили і взаємозв'язку зі середовищні фактори. Ті, хто перетинав в ході подорожей безліч часових поясів, знають, що при цьому організм спочатку не може підлаштуватися під новий світловий день, але через кілька днів циркадні ритми синхронізуються з реальністю, і життя знову стає прекрасна, а сон міцний.

За таку настройку, як виявилося, відповідає цілий набір білків-регуляторів, що впливають на все той же осцилятор PER-TIM (рис. 3 б). Наприклад, Янг виявив білок CRY, який активується у відповідь на підвищення зовнішньої освітленості, пов'язує TIM і відправляє його на деградацію. Таким чином, раннє або пізніше ранок змінюють характеристики піку TIM, що в свою чергу змінює профіль експресії PER. Через кілька днів циркадний ритм стабілізується в новому положенні.

Всі ці дані і успішно підтверджені гіпотези досить сильно змінили наше розуміння циркадних ритмів. Теорія про внутрішній осцилляторе була однозначно підтверджена завдяки зусиллям Холла, Росбаша і Янга, за що вони цілком заслужено отримали Нобелівську премію [4] . Але дослідження цієї цікавої області все ще тривають.

Чи не мухами єдиними ...

Мухи - це, звичайно, добре, але що там у ссавців взагалі і у людини зокрема? У нас все виявилося схоже загалом, але відмінно в деталях. Циркадні ритми у ссавців діляться на центральні і периферичні. Центральним регулятором виступає супрахіазматіческое ядро ​​гіпоталамуса в головному мозку [5] . При зміні ритму освітленості воно є першим перебудовує свій цикл активності системи білків PER. Під контролем цього ядра йде виділення мелатоніну (гормону сну) в епіфізі, через який воно регулює циркадні ритми в інших тканинах організму.

На білки циркадного каскаду виявилися зав'язані багато фізіологічні функції клітин і тканин (рис. 4). Наприклад, вранці інсуліновий відповідь підшлункової залози на споживання вуглеводів більш яскравий, ніж увечері. І це навіть не виходить пояснити нічний «голодуванням» - тварини, яким 24 години з постійною швидкістю вводили в кров глюкозу, мали найменший її рівень (і найбільший рівень інсуліну) вранці. Аналогічно змінюється засвоєння жирів і білків. Таким чином, рада «не їсти після 18», настільки частий у фітнес-журналах, виявляється, має під собою фізіологічне обгрунтування [6] .

Малюнок 4. Багато аспектів функціонування людського організму залежать від часу доби і контролюються циркадних ритмів.

Циркадні ритми взагалі впливають майже на всі області нашої фізіології. Від часу доби залежать наша працездатність, рівні майже всіх основних гормонів, захворювання і так далі. Зрозуміло, вже є групи, які освоюють гранти в питаннях зв'язку порушених циркадних ритмів і раку, нейродегенеративних і серцево-судинних захворювань [7] та інших цікавих тем.

Дуже перспективними є дослідження зв'язку циркадних ритмів і старіння. Відомо, що супрахіазматіческое ядро ​​з віком деградує і до старості працює вже не так регулярно. Старі люди достовірно гірше адаптуються до зміни часових поясів, гірше переносять вимушене неспання і відновлюються під час сну. На гризунах дослідники показали, що порушення генів циркадних ритмів веде до значного зниження тривалості їх життя і, що досить цікаво, до більш ранньої появи «старечих» захворювань [8] .

Подальший розвиток

На даний момент добова біологія розвивається шаленими темпами. Вивчають варіанти фармакологічного впливу на циркадні ритми, особливо порушені внаслідок перельотів, віку або захворювань. В аптеках вже можна купити препарати мелатоніну для мандрівників.

Хоча система TTFL, заснована на білках PER і TIM, є найпомітнішою серед циркадних годин, вона не є єдиною [9] . C моменту вчинення основних відкриттів групами Холла / Росбаша і Янга було відкрито ще кілька варіантів. Наприклад, система білків Kai, керуюча циркадних ритмів ціанобактерій, заснована не на синтезі / розпаді, а на фосфорилировании / дефосфорилюванні ключового білка KaiC [10] . Завдяки цьому, дану систему вдалося відтворити в пробірці - змішання всіх необхідних білків і їх субстратів призвело до виникнення молекулярного годинника без участі живої клітини.

Та й сама система TTFL ще не вивчена до межі. Те, що ми виявили осцилятор і розібралися в тонкощах його роботи і регуляції - це, звичайно, прекрасно. Але залишається ще маса питань щодо його взаємодії з різними біохімічними каскадами і фізіологічними функціями наших клітин. Так що для майбутніх дослідників тут є ще дуже багато роботи.

1. 12 методів в картинках: полімеразна ланцюгова реакція ;
2. 12 методів в картинках: секвенування нуклеїнових кислот ;
3. Konopka RJ and Benzer S. (1971). Clock mutants of Drosophila melanogaster . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 68, 2112-2116;
4. Ibáñez C. (2017). Scientific background discoveries of molecular mechanisms controlling the circadian rhythm . Nobelprize.org;
5. «Прокинься!» - «Засни ...» - «Прокинься!» - «Засни ...» - «Прокинься!» ;
6. Satchidananda Panda. (2016). Circadian physiology of metabolism . Science. 354, 1008-1015;
7. Молекулярні годинник нашого серця ;
8. Сон і старіння I: «Годинник в мозку» і вплив генів на ритм життя ;
9. Прообраз біологічного годинника ;
10. T. Kondo. (2007). A Cyanobacterial Circadian Clock Based on the Kai Oscillator . Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 47-55.