Интернет журныл о промышленности в Украине

ЭРГономика самообновления гемопоэтических стволовых клеток

Самообновление относится к событиям деления клеток, во время которых, по крайней мере, одна из двух дочерних клеток остается идентичной своей матери. Хотя существуют примеры для самообновления дифференцированных типов клеток, это в основном процесс, используемый стволовыми клетками для получения большего количества стволовых клеток. Самообновление контролируется взаимодействием внутренних молекулярных путей клетки с динамическими внешними сигналами, представленными микросредой клетки. Естественная среда для стволовых клеток называется нишей: тканеспецифическое анатомическое место жительства, которое часто изменяется в процессе развития и обеспечивает надлежащую среду для регулируемых переходов между покоем стволовых клеток, самообновлением и дифференцировкой. При воздействии соответствующих сигналов стволовые клетки выходят из состояния покоя и проходят через симметричные клеточные деления, чтобы увеличить их количество, или подвергаются асимметричным клеточным делениям. Тканевые стволовые клетки возникают во время развития, приобретают способности к самообновлению и поддерживают эту способность в устойчивом состоянии взрослого органа, когда самообновление может быть активировано во время регенерации в ответ на повреждение ткани.

Гематопоэтические стволовые клетки (ГСК) лучше всего характеризуются из всех тканевых стволовых клеток. У эмбрионов млекопитающих дефинитивные HSC впервые появляются на эмбриональном дне 10,5 (E10,5) в виде скоплений, выходящих из брюшной стенки дорсальной аорты - области, называемой мезонефрос аорты-гонады (AGM) ( Бертран и др. 2010 ; Boisset et al. 2010 ; Кисса и Гербомель 2010 ). Из AGM HSC мигрируют в ниши в печени и тимусе плода до постоянного проживания в костном мозге, где они проживают от E15.5 до E18.5 в течение всей жизни организма. HSC являются мультипотентными, вызывая иерархические линии миелоидных и лимфоидных клеток и ряд дифференцированных типов клеток. Существуют многочисленные инструменты для характеристики самообновления и дифференциации HSC. Они могут быть проспективно выделены с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с соответствующими маркерами клеточной поверхности и трансплантированы, после химической или индуцированной радиации абляции, реципиентам, где они могут восстановить всю систему крови. Варианты этого трансплантационного анализа годами использовались в клинике при лечении различных заболеваний крови, и он остается золотым стандартом для измерения самообновления и дифференцировки ГСК. Визуализация тканей эмбриональных и взрослых популяций и ниш крови, а также использование трансгенных для тканеспецифических генетических манипуляций предоставляют исследователям более прямые методы для характеристики биологии HSC. Создание этих инструментов оказалось парадигматическим, поскольку ученые, изучающие стволовые клетки других тканей, стремятся реализовать методы, аналогичные тем, которые используются для ГСК ( Оркин и Зон 2008 ).

Неудивительно, что молекулярный контроль самообновления стволовых клеток включает механизм клеточного цикла. В то время как эмбриональные стволовые клетки (ESCs) демонстрируют неограниченное самообновление, частично благодаря их митоген-независимому статусу Rb, контроль G1-S-переходов в тканевых стволовых клетках сильно зависит от сигнальных событий, которые действуют положительно и отрицательно через p16Ink4a– CDK4 / 6 – Rb и p19Arf – p53 – p21Cip1pathways. При сбивании или избыточной экспрессии компоненты этих путей обнаруживают различные дефекты HSC. Было показано, что пути развития, такие как Bmp, Wnt и Notch, влияют на активность HSC, как и химические модуляторы, такие как простагландин E2 и ретиноевая кислота. Эти сигналы координируются пространственно и временно во время развития, чтобы сбалансировать состояние покоя HSC с самообновлением и дифференцировкой, а также для определения, вместе с кодом cdx-hox, идентичности клеток любого потомства ( Lengerke и соавт. 2008 ). На уровне ДНК факторы хроматина (такие как BMI1, MLL и DNMT3A / B) и факторы транскрипции (такие как SOX17) создают эпигенетическое игровое поле HSC с областями транскрипционно молчащего гетерохроматина и активного эухроматина. Поскольку стволовые клетки сигнализируют об отсутствии активности и асимметричном делении самообновления, мастер-регуляторы транскрипции индуцируются для реализации спецификации ткани. Считается, что эти факторы транскрипции работают комбинаторно и дозозависимо, как на ранних, так и на поздних стадиях дифференцировки, чтобы исказить выбор линии. Наиболее характерный пример этого происходит в точке разветвления между спецификацией эритроцитов и лейкоцитов. В общей клетке-предшественнике регулятор эритроцитов GATA1 и миелоидный регулятор PU.1 физически взаимодействуют на уровне белка, а также подавляют транскрипцию друг друга, что приводит к модели «подсчета молекул» для выбора линии ( Зон 2008 ; Оркин и Зон 2008 ; Он и соавт. 2009 ).

Все эти молекулярные события управляют различными аспектами биологии ГСК, но по мере роста нашей базы знаний назначение определенного фактора одному процессу - т.е. самообновлению или спецификации - все больше зависит от технических достижений, тонкого экспериментального дизайна и тщательная интерпретация данных. Было показано, что для спецификации HSC требуется несколько факторов, но они показывают необязательные или тонкие роли для поддержания или функционирования HSC. Например, потеря RUNX1 / AML1 или SCL во время развития приводит к полному отсутствию всей определяемой крови, тогда как условные аблации в более позднем возрасте приводят к небольшому количеству гематопоэтических дефектов ( Миккола и соавт. 2003 ; Чен и соавт. 2009 ). Это может быть связано с избыточностью членов семьи, как это было недавно обнаружено для основных факторов спирали-петли-спирали SCL и LYL, при которых двойной нокаут действительно приводит к дефекту самообновления у взрослых ГСК ( Souroullas et al. 2009 ). Регуляция самообновления или поддержания HSC также была молекулярно отделена от спецификации: условная потеря либо ZFX, либо TEL / ETV6 приводит к истощению HSC у взрослых с соответствующей дифференциацией по линии перед истощением, а SOX17 необходим для поддержания HSC печени плода ( Hock et al. 2004b ; Galan-Caridad et al. 2007 ; Ким и соавт. 2007 ). Некоторые гены необходимы для множественных аспектов гемопоэза: PU.1 участвует в миелоидной дифференцировке и поддержании HSC ( Бурда и соавт. 2010 ), GFI1 требуется для созревания нейтрофилов и поддержания HSC у взрослых ( Hock et al. 2003 ; Zeng et al. 2004 ), и GATA2 необходим для спецификации эмбриональных HSC, дифференцировки тучных клеток и гомеостаза взрослых HSC ( Tsai et al. 1994 ; Цай и Оркин 1997 ; Родригес и др. 2005 ). Большинство из этих наблюдений стали возможными только с помощью сложных методов, таких как креа-индуцируемые индуцибельные нокаутные аллели, которые позволяют отделить ранние летальные фенотипы от важнейших ролей в дальнейшей жизни.

Одним геном, который становится все более интересным, является фактор транскрипции ERG. ERG принадлежит к семейству ДНК-связывающих белков ETS, члены которого имеют решающее значение для развития множества тканей. В целом, семейство ETS, как полагают, регулирует взаимодействия мезенхима-эпителиальный и внеклеточный матрикс ( Трояновская 2000 ). Было показано, что ряд белков ETS, включая PU.1, FLI1 и TEL / ETV6, играют критическую роль на каждом уровне кроветворения ( Марулаку и Боу 2000 ). Сама ЭРГ усечена, транслоцирована или сверхэкспрессирована при множественных типах рака, в частности, при раке простаты и лейкемии, и действует как онкоген при остром мегакариобластном лейкозе ( Кларк и Купер 2009 ; Салек-Ардакани и соавт. 2009 ). Первоначальные исследования на мышах с мутацией зародышевой линии, нарушающей трансактивацию ERG, показали несколько гематопоэтических фенотипов. Гомозиготные мутанты демонстрируют нормальный примитивный гемопоэз, но умирают внутриутробно между E10.5 и E13.5 с дефектным дефинитивным гемопоэзом, что измеряется с помощью анализов колоний культуры желточного мешка. Гетерозиготные животные демонстрируют низкие лейкоциты, тромбоциты и колониеобразующие единицы селезенки (КОЕ), образуя вдвое меньше колоний предшественников костного мозга, распространяющихся по всем линиям, и гетерозиготный мозг не может конкурировать с костным мозгом дикого типа в анализах трансплантации ( Loughran et al. 2008 ). Вместе данные свидетельствуют о роли ERG в самообновлении и / или функционировании HSC. После этих исследований было доказано, что ERG регулирует мегакариопоэз, ангиогенез и эндотелиальный апоптоз и необходим для дифференцировки ESC в направлении эндотелиальной судьбы ( Бердси и др. 2008 ; Kruse et al. 2009 ; Николова-Крстевский и соавт. 2009 ; Станкевич и Криспино 2009 ).

В выпуске Genes & Development от 1 февраля 2011 года Тауди и соавт. (2011) расширить эмбриональный гемопоэтический анализ ранее опубликованной мутации в области трансактивации ERG. Поскольку гомозиготные мутантные эмбрионы показывают крутой кривой гибели между E10,5 и E11,5, Тауди и соавт. (2011) установить, чтобы охарактеризовать детали гематопоэтических дефектов в эти моменты времени, используя более тщательные методы, чем были использованы ранее. В то время как примитивная гемопоэтическая спецификация была нормальной у гомозигот ERG между E8.5 и E9.5, клетки всех линий крови были истощены E10.5, как измерено положительностью CFU-S и CD45 в желточном мешке. Интересно, что несмотря на нормальное окончательное образование HSC на E10.5, экспланты AGM с последующей индукцией HSC in vitro показывают, что ERG-мутантные кластеры аорты HSC не могут поддерживать гемопоэз после трансплантации облученным мышам. В то время как мутантные клетки CD45 + были нормальными в AGM в более ранние моменты времени и оставались нормальными после процедуры эксплантации, подсчеты CFU-C в тех же точках анализа показывают потерю активности эксплантированных клеток, которая считывается по всем линиям клеток крови. Несмотря на эту потерю устойчивого расширения, мутантные HSC способны возвращаться в печень и плаценту. Тауди и соавт. (2011) использовали анализ химеры, чтобы выяснить, насколько хорошо мутантные клетки могут вносить вклад в гематопоэтические компартменты внутри здорового животного. GFP + мутанты дикого типа, гетерозиготные или гомозиготные мутанты агрегировали с эмбрионами GFP - дикого типа, выращивали до бластул и инъецировали псевдобеременным самкам. Мутантные клетки могли вносить вклад в периферическую кровь, печень плода и тимусные CD45 + клетки, сравнимые с клетками дикого типа на E14.5, но гораздо меньше на E18.5. С другой стороны, гомозиготные и гетерозиготные клетки демонстрировали более низкий химеризм в компартменте HSC в оба момента времени. Важно отметить, что сходный низкий уровень химерности CD45, Lin + и HSC от мутантных клеток наблюдался в костном мозге E18.5 как печень плода E18.5, что позволяет предположить, что дефект посева не ответственен за фенотипы взрослых. В заключение, Тауди и соавт. (2011) показывают снижение экспрессии мРНК Gata2 и Runx1 в мутантных клетках печени плода, а также специфическое для печени обогащение ERG в обоих энхансерах Gata2 и Runx1 с помощью иммунопреципитации хроматина (ChIP). Представлена ​​модель, в которой ERG требуется для активации Gata2 и Runx1 , которые синергетически необходимы для поддержания HSC после гематопоэтической спецификации ().

Представлена ​​модель, в которой ERG требуется для активации Gata2 и Runx1 , которые синергетически необходимы для поддержания HSC после гематопоэтической спецификации ()

Спецификация HSC в AGM раннего эмбриона мыши зависит от активности как RUNX1, так и GATA2, но не зависит от ERG. Тауди и соавт. (2011) наблюдали нормальные уровни ранних предшественников и внутриаортальных кластеров HSC у эмбрионов-мутантов Erg. Все мутанты Gata2 , Runx1 и Erg демонстрируют способность к самонаведения в ниши печени и костного мозга плода. В этих нишах GATA2 и RUNX1 демонстрируют избыточное требование для самообновления HSC. Тауди и соавт. (2011) предположить, что основным требованием для ERG при самообновлении является прямая активация как Gata2, так и Runx1 , так что потеря активности ERG приводит к низким уровням каждого фактора, особенно на более поздних стадиях, а не во время спецификации. Мы благодарим Стивена Московича за помощь в создании фигуры.

Один из аспектов этого исследования раскрывает суть ключевых вопросов самообновления стволовых клеток: как дефекты самообновления проявляются на клеточном уровне и является ли самообновление отделимым фенотипом от других аспектов биологии ГСК? Исчерпание HSCs у эмбрионов-мутантов ERG интригует: нормальное количество внутриаортальных кластеров исключает дефекты спецификации, а обнаружение вклада мутантных клеток в фетальную печень, плаценту и кроветворение костного мозга, хотя и значительно сниженное, также исключает дефекты в возвращении и занятии второстепенных ниш. Если нормальные симметричные или асимметричные HSC-процессы самообновления становятся событиями дифференцировки у мутантов, то можно ожидать всплеска гемопоэза у мутантов, однако Тауди и соавт. (2011) не обнаружить такой взрыв. Если деления самообновления происходили нормально, но полученные ГСК исчезали, тогда можно было бы ожидать увеличения апоптоза, но такого увеличения не было обнаружено. Исключая технические ограничения, одна возможность состоит в том, что нормальные симметричные подразделения самообновления (расширения) становятся асимметричными событиями самообновления. Это приведет к низкому уровню нормальной функции HSC, что согласуется с наблюдаемыми фенотипами.

Второй аспект этого исследования напрямую касается молекулярных механизмов, лежащих в основе перехода между спецификацией HSC и поддержанием HSC. Пожалуй, самые яркие эксперименты, выполненные Тауди и соавт. (2011) являются чипами для ERG в локусах Runx1 и Gata2 . Стоит отметить, что Тауди и соавт. (2011) не исключаю, что различие между AGM и сигналом ERG печени может просто отражать процент соответствующих типов клеток в двух тканях. Кроме того, так как по крайней мере один другой ген, важный для поддержания HSC, - GFI1 - был вовлечен в качестве прямой цели ERG ( Уилсон и соавт. 2010b ), возможно, что фенотип ERG связан с потерей того или иного взаимодействия. Несмотря на эти предостережения, снижение уровней мРНК Gata2 и Runx1 в печени в сочетании с данными ChIP является убедительным аргументом для предлагаемой модели, особенно в свете недавних исследований, демонстрирующих сильные дефинитивные гематопоэтические дефекты в сложных гетерозиготных мутантах для Runx1 и Gata2 ( Уилсон и соавт. 2010a ). Эта модель помещает ERG в молекулярный переход между спецификацией HSC и поддержанием HSC - первая является независимой от ERG и индивидуально зависимой как от GATA2, так и от RUNX1, а вторая зависит от синергетической активности RUNX1 и GATA2, которая стимулируется трансактивацией ERG.

Это исследование поднимает несколько интересных вопросов. (1) Почему существует необходимость в синергетической активности RUNX1 и GATA2? Возможно, домены хроматина в HSC печени отличаются от доменов в AGM, что приводит к необходимости более сильной активации или подавления аналогичного набора генов. Или, возможно, в печени необходим совершенно новый набор мишеней RUNX1 и GATA2, и эти два фактора действуют в белковых комплексах, состоящих из разных кофакторов. Существуют доказательства того, что GATA2 и RUNX1 могут физически взаимодействовать друг с другом на уровне белка ( Уилсон и соавт. 2010a ). Возможно, что оба находятся в одном комплексе в печени, но в отдельных комплексах во время спецификации AGM. Сравнение прямых целей RUNX1 и GATA2 с ChIP-seq из двух тканей было бы полезным в этом отношении. (2) Как регуляторы развития взаимодействуют с ERG и изменением требований RUNX1 и GATA2? Как обсуждалось выше, известно, что пути Bmp, Wnt и Notch влияют на кроветворение во время развития. RUNX1 может спасать HSCs у эмбрионов-мутантов рыбок данио, и GATA2 был расположен ниже Bmps во время эмбрионального кроветворения ( Маэно и соавт. 1996 ; Бернс и соавт. 2005 ; Далгин и соавт. 2007 ). Недавно было показано, что ERG активирует путь Wnt в исследованиях рака предстательной железы ( Гупта и соавт. 2010 ). Вполне вероятно, что сигналы развития интегрированы на уровне тканеспецифических факторов транскрипции, но молекулярные механизмы, регулирующие эту интеграцию, в основном неизвестны. Профилирование транскрипции различных популяций HCS во время развития пролило бы свет на эти темы, так же как и ChIP для ядерных компонентов сигнальных путей в различных типах кроветворных клеток.

ЭРГ может быть одним из лучших примеров гематопоэтических клеточно-автономных факторов, действующих в основном в процессе самообновления стволовых клеток на всех этапах жизни. ИМТ1, наиболее характеризующийся фактор самообновления ГСК, отличается от ЭРГ по времени своего фенотипа (эмбриональный для Erg и постнатальный для ИМТ1) и где он функционирует ниже по потоку от ГСК (лимфоциты для ИМТ1 и мегакариоциты для ЭРГ) ( van der Lugt и соавт. 1994 ; Парк и соавт. 2003 ; Kruse et al. 2009 ). Фенотипы Erg отличаются от таковых у ZFX тем, что Erg необходим как для самообновления HSC эмбрионов, так и для взрослых, в то время как ZFX требуется только для взрослых HSC, а дефект самообновления ZFX можно объяснить увеличением апоптоза, тогда как дефект Erg не могу ( Galan-Caridad et al. 2007 ). Sox17 также имеет объяснение гибели клеток для своего специфического для плода дефекта самообновления HSC ( Ким и соавт. 2007 ), как и Etv6 для его специфичного для взрослых фенотипа HSC. Помимо своей роли в производстве лимфоидных клеток и нейтрофилов, Gfi1 также демонстрирует специфический для взрослых фенотип самообновления ГСК, но поддерживает относительно нормальные уровни ГСК ( Hock et al. 2004a ; Zeng et al. 2004 ). Хотя было бы интересно увидеть полный условный нокаут Эрг в гематопоэтическом компартменте для более непосредственного сравнения его взрослых фенотипов с этими другими факторами, дефекты плода Эрг выделяются среди известных генов самообновления HSC.

Еще одна тема в истории ERG заслуживает особого внимания. Аллель ERG, использованный в этих исследованиях, был обнаружен с помощью впечатляющего скрининга мутагенеза на фоне, который был мутантным по отношению к рецептору тромбопоэтина (mpl). Хотя мутантный аллель ERG имеет фенотип в отсутствие мутации mpl, эмбриональные исследования не могли бы проводиться без сильных фенотипов Mpl - / - Erg +/- для взрослых. По мере того, как мы выявляем больше молекулярных деталей, касающихся спецификации HSC и самообновления, становится важным выходить за рамки анализа одного гена и тестировать более сложные генетические взаимодействия между регуляторными путями. Это дополнительно иллюстрируется синергетическими требованиями к RUNX1 и GATA2 в поддержании HCS плода и избыточными активностями LYL1 и SCL ( Souroullas et al. 2009 ; Уилсон и соавт. 2010a ). Мы будем только дразнить эти неуловимые отношения, используя преимущества новейших моделей и методов.

Как мы можем найти новые факторы, связанные с самообновлением HSC? Прямой генетический скрининг у мышей - все более и более осуществимые методологии для биологии HSC, с растущей пропускной способностью анализов, таких как FACS и гематологический анализ ( Loughran et al. 2008 ; Папатанасиу и соавт. 2010 ). Обратные генетические методы с участием РНКи были успешно использованы для выявления факторов, которые регулируют самообновление ГСК ( Надежда и соавт. 2010 ). Кроме того, будут изучены другие партнеры по лейкозной транслокации, и продвинутая живая визуализация трансгенного репортера будет продолжать помогать характеризовать точные фенотипы in vivo ( Бертран и др. 2010 ; Boisset et al. 2010 ; Кисса и Гербомель 2010 ). Биохимия вместе с секвенированием следующего поколения и количественной масс-спектрометрией являются мощными, быстро развивающимися технологиями, которые уже доказали свою полезность и имеют большие перспективы ( Baek et al. 2008 ; Spooncer et al. 2008 ; Уилсон и соавт. 2010a ). Химическая генетика, особенно у эмбрионов рыбок данио, оказалась плодотворной для выявления гематопоэтических регуляторных путей ( North et al. 2007 ; Yeh et al. 2009 ; Пайк и др. 2010 ). Методы, используемые Тауди и соавт. (2011) представляют ключевые достижения в исследованиях клеточной культуры и химер и подчеркивают сохраняющуюся силу более устоявшихся подходов. В конечном счете, сочетание старых и новых технологий, несомненно, даст глубокое понимание самообновления HSC.

Почему существует необходимость в синергетической активности RUNX1 и GATA2?
Как регуляторы развития взаимодействуют с ERG и изменением требований RUNX1 и GATA2?
Как мы можем найти новые факторы, связанные с самообновлением HSC?